Návrh definovaného media pro kultivaci Serratia marcescens při studiu produkce nukleáz.
Jiří Antonín Votýpka, Praha, 1973
Úvod.
Výskyt a význam serácií v přírodě.
Význam druhu Serratia marcescens byl donedávna značně podceněn. Nejčastěji byl uváděn jako zajímavý příklad lipolytického organismu, neškodného saprofyta, fytopatogena, producenta prodigiósinu používaného k léčbě kokcidiomykóz a organismu používaného při vytváření anaerobního prostředí.
Seracie jako lidské pathogeny
Téměř závratně stoupl během posledních let výskyt infekcí, jejichž původcem byly prokazatelně kmeny Serratia marcescens. I přes tyto výsledky jsou někdy uváděny serácie jako organismy pro člověka nepatogenní nebo jejich etiopatogeneze je dosud nevyjasněná. O cíleném sledování serácií při rutinním vyšetřování nemůže být ani dnes řeči. Nedávno byly v zahraničí navrženy nové selektivní a diagnostické živné půdy pro izolaci serácií pro rutinní vyšetřování klinického materiálu.
Léčba zhoubných nádorů při použití serácií
Již dlouhou dobu je využívána serácie při léčbě zhoubných nádorů.
Je součástí Coleyových toxínů, které se aplikují různým způsobem při léčbě některých neoperovatelných zhoubných nádorů. Výrazné úspěchy při léčbě byly podnětem pro studium serácií. Postupem času byly zkoušeny i jiné rody a druhy mikroorganismů v tzv.MBT látkách. Vysvětlení účinku Coleyových toxínů a MBT látek v regresi nádorů se pokouší objasnit hypotéza o nespecifické stimulaci imunogenního systému organismu, obecně přijatá. Vznikla však i hypotéza, která počítá s uplatněním mimobuněčných nukleáz, respektive deoxyribonukleáz a ribonukleáz.(9)
Produkce enzymů štěpící nově tvořenou a nádorovou DNA
Pro studium produkce a aktivity produkovaných nukleáz u různých kmenů serácií je nutné, aby kultivační prostředí bylo dostatečně saturováno živinami a neobsahovalo složky inhibující tvorbu nukleáz. Zároveň nesmí být medium toxické pro lidské buňky. Pro zjednodušení imunologického hodnocení produkovaných látek, by neměla živná půda obsahovat žádné antigenní složky. Vzhledem k tomu,že většina komplexních živných půd obsahuje antigenní složky (například tyrosin) byla pozornost věnována syntetickým definovaným mediím.
V novější literatuře bylo nalezeno 22 plně definovaných minerálních medií pro kultivaci různých enterálních mikroorganismů, některé byly určeny přímo pro kultivaci druhu Serratia marcescens. Většina je určena pro tvorbu pigmentu – marcesceinu. Jsou buˇpříliš nutričně chudá, osmoticky neodpovídají poměrům in vivo, nebo obsahují citráty , případně i různé antigeny. Obsah citrátů v živné půdě, kde má být studována mimobuněčná nukleáza je nepřijatelný. Je známo, že citrany patří ,mezi inhibitory například deoxyribonukleáz.
Originální definované medium pro studium nukleáz u serácií
Protože nebylo nalezeno v literatuře vhodné medium pro studium vztahu nukleázy serácií a nádorových buněk, bylo po pokusech sestaveno a prověřeno nové vhodné živné medium tohoto složení označené jako SM:
Rp. NaCl 1,4g, KCl 1.0g, MgSO4.7H2O 0,2g, l-ornithin 0,1g, l-asparagin 1.0g, glukosa 10,0g destilovaná voda 1000 ml.
Jednotlivé složky postupně rozpustíme zahříváním, hodnotu pH (je kolem 5,0) neupravujeme, sterilizujeme autoklávováním 10 minut při 121 C. Po ochlazení přidáme asepticky sterilní roztok K2HPO4 (10 %ní) tak aby konečná koncentrace činila v médiu 0,5 % . V případě, že chceme zvýšit produkci nukleáz je vhodné zvýšit obsah MgSO4.7H2O do konečné koncentrace 0,5 % pro ochranu nukleáz lze přidávat po sterilizaci sterilní roztok jodidu draselného až do koncentrace 0,1 %. Zvýšením obsahu K2HPO4 do finální koncentrace 1 % se podpoří tvorba pigmentu.
Lze též připravit pevné agarové SM medium:
Navážku substancí pro SM medium na jeden litr přidáme k 500 ml destilované vody a sterilizujeme výše uvedeným způsobem.Množství agaru na jeden litr (1-2% podle druhu agaru) přidáme k 500 ml destilované vody, necháme nabobtnat 20 minut, rozvaříme při 100 C za 40 minut a sterilizujeme autoklávováním při 121 C po dobu 20 minut. Sterilní složky ochlazené na 60 C smísíme. Přidáme stejné množství roztoku K2HPO4 jako do tekutého media, důkladně promícháme bez tvorby pěny a rozléváme do sterilních Petriho misek.
Po naočkování inkubujeme nejlépe při 20-23 C při denním osvětlení. Lze též rychleji dosáhnout růstu i při 37 C ve tmě.
Materiál.
Bakteriální kmeny.
Bylo použito celkem 9 kmenů druhu Serratia marcescens,indica, plymuthica,dedm kmenů sbírkových, 2 kmeny čerstvě izolované z odpadní vody a klinického materiálu. Serratia marcescens orig.W.H.Ewing L 437-441, Serratia indica orig. ATCC 4002, Serratia plymuthica, orig. ATCC 183, Seratia marcescens, izolace z vody, orig. IHE 1973, Serratia marcescens, orig. izolace z lidské moči, orig. KHES Středočeský kraj, 1973. Všechny kmeny byly biochemicky ověřeny. Pomocí testů používaných pro identifikaci stafylokoků byl sledován u uvedených kmenů výskyt tvorby hemolysynů, fosfatázy, volné koagulázy a fibrinolyzínu proti lidské plasmě, lecitinázy, lipázy, DNázy, proteázy, gelatinázy, amylázy. DNáza byla stanovena pomocí čtyř metodik a použitím dvou druhů DNA. Navíc byla stanovena citlivost jednotlivých kmenů na furadantin, chloramfenikol, polymyxin, degydrostreptomycin, tetracyklin, bacitracin a penicilin diskovou metodou.
Kultivační půdy, sklo, voda.
Původně lyofilizované kmeny byly během práce uchovávány na živném agaru Nutriet Agar Oxoid. Prakticky bylo vyzkoušeno 22 druhů definovaných medií obsahující citrany i bez citranů. Ze souboru byla vybrána čtyři media s nejsilnějším růstem ke srovnání s navrhovaným mediem. Jsou to 1. CA medium (5), 2. Erythriol medium modifikace bez erythriolu a agaru, (2) , 3. Minimal medium MM, (4), 4. Minimal salts solution MSS (7). Soubor srovnávaných kultivačních půd byl doplněn komplexním živným bujónem Nutriet Broth Dufci. Ke kultivaci bylo používáno erlenmayerových baněk o obsahu 300 ml, značky Simax a zkumavky značky Neutral Sial. Pro fotometrické měření bylo použito zkumavek Kimble K Brand 16.125 mm. K přípravě kultivačních půd bylo používáno výhradně destilované vody ze skleněného destilačního přístroje.
Metodika.
Při sestavování nového media se vycházelo z kvalitativně i kvantitativně modifikovaných solí používaných v mediích pro tkáňové kultury linií buněk. Ve snaze neomezovat aktivitu nukleáz nebylo použito citranů a byl zkoumán projektivní účinek solí jódu. (Jó je antagonistou arsenu, prvku, který je nejrozšířenějším inhibitorem nukleáz) Zkusmo byly přidány jednotlivé aminokyseliny a vitamíny v různých kombinacích a koncentracích. U všech složek byla stanovena optimální koncentrace. Media byla připravována vždy tak, aby byla zcela čirá. Inokulum bylo standardizováno odměřením bakteriální suspenze vyrostlé na syntetickém mediu (č.3 – Minimal medium), dvakrát promyté ve sterilním fyziologickém roztoku a nesuspendované tak, aby byla dosažena hodnota trasmise 60% T. Na 100 ml media bylo použito 0,2 ml inokula. Kultivační teplota byla 18-23 C – běžná laboratorní teplota. Kultivace byla statická při denním osvětlení.
Množství vzniklých bakteriálních buněk za určitou dobu bylo vztaženo na optickou hodnotu zákalu a fotometricky změřeno. K měření byl používán Spektrophotometer Junior Coleman Electric Co. Měřilo se v kulatých kyvetách o průměru 16 mm při vlnové délce 560 nm proti sterilnímu mediu.
Všechny pokusy byly prováděny v 100 ml a výsledky byly ověřeny opakovanými pokusy. Po odečítání byl kultivačně kontrolován a potvrzen použitý bakteriální druh.
Výsledky.
Z devatenácti několikastupňových pokusů bylo zjištěno jak se uplatňuje vliv jednotlivých součástí syntetického i komplexního media na růst bakterie Serratia marcescens.Některé zajímavé jsou zde uvedeny:
1.Jodid draselný
V komplexním mediu (0,3% Beef Extrakt, 1% Neopeptonu a Trast extraktu, vše od firmy Dufci) je nejvyšší růst při koncentraci 0,5%, zatímco u definovaného minimálního media v koncentraci 0,1 %.
2.Modifikované HL-sole (6)
(V 1 litru obsahuje: NaCl 1,4g, KCl 0,32g, MgSO4.7H20 0,16 g, Na2HPO4 . 12 H2O 0,08 g, KH2PO4 0,05 g) Ideální koncentrace HL směsi solí je 1% pro komplexní media. Pro definovaná media viz dále body 3-7.
3.FeCl3 . 6H20.
V definovaném mediu se uplatňuje mírně ale jasně inhibiční účinek.
4.MgSO4 . 7H2O.
Ideální koncentrace v definovaném mediu je 0,5 %
5.Druh použité vody.
Pro přípravu komplexního i definovaného media je nejlepší destilovaná voda ze skleněného destilátoru, pak voda vodovodní (Praha 10) a nejméně vhodná je voda z kovové destilační aparatury (Chirana)
6.K2HPO4.
Nejvyššího nárustu lze dosáhnout při koncentraci 0,5-1,0 %. Zvýšený obsah fosfátu vede k produkci pigmentu i v tekutém mediu.
7.Glukóza.
V definovaném mediu je ideální koncentrace 1%, koncentrace 0,4 % opakovaně se jevila v několika modifikacích jednoznačně inhibičně. Důvod neznám.
8.Aminokyseliny.
Serratia marcescens je schopna růst v přítomnosti anorganických solí, glukózy, asparaginu a ornithinu. Ideální koncentrace asparaginu je 0,1% u ornithinu 0,01 %. Lze též zaznamenat růst v mediu, které obsahuje jen 1% asparaginu a 1% glukózy v destilované vodě. Intenzita růstu je však o 30 % nižší. Též je možné kultivovat serácie v roztoku anorganických solí, glukózy, 0,5 % KJ a 0,1 % histidinu. Jsou-li však přidány histidin nebo uracil do medií za jiných podmínek, projevují se jejich inhibiční účinky.
9.Vitamíny.
Přidání komplexu vitamínů (Ca-panthotenát, niacinamid, pyridoxal, pyridoxalamin, riboflavin, kys.listová, inositol, p-aminobenzoová kyselina vše po 0,35 mg%, pyridoxal, thiamin, cholin vše po 3,5 m% a biotin 0,03mg% a kyselina lipoová 0,01%) zvýšilo růst jen nepatrně. V definovaném mediu s 0,5% KJ zvyšovala kyselina nikotínová v koncentraci 2mg% růst o 18 %, thiamin, riboflavin a kyselina askorbova jen nepatrně. Kyselina p-aminobenzoová inhibovala částečně růst v koncentraci 2mg%.
Při kultivaci serácií v Casitone Difco při koncentraci 1% byl nárust v ve stejném mediu Casitone Difco bez vitamínů o 11,5 % vyšší než ne v kasilonu komplexním s vitamíny!
10.Některé jiné sloučeniny.
Serratia marcescens je schopna růst ve vysokých koncentracích acetamidu a bromidu draselného. Zcela inhibují růst serácií chlorid měďnatý, molybdenan amonný, teluričitan draselný, kyselina benzoová a sorbová, seleničitan sodný při koncentracích vyšších než 0,5 %. Chlorid sodný inhibuje v koncentracích od 5 %, kyselina boritá od 0,5-0,7 % v závislosti na kvalitě media.
11.Velikost inokula.
Přídavek jedné kapky až 1,0 ml bakteriální suspenze s extinkcí 0,201 k 100 l media ovlivnilo intenzitu růstu po 40 hodinách jen o 10 %.
12.Exponeciální fáze růstu.
Nejvyššího přírustku lze dosáhnout v definovaném mediu s 1% glukózy po 20-21 hodinách statické kultivace při teplotě 18-23 C.
13.Inkubace.
Nejvýhodnější je inkubace při laboratorní teplotě (20-23C) od 40 do 72 hodin, pokud možné při denním osvětlení.
14.Sterilizace živného media.
U definovaných medií je nejvýhodnější sterilizace solí a glukózy společně při nízkém ph (kolem 5,0) 10 minut autoklávováním při 121 C. Po sterilizaci a ochlazení se přidává sterilní 10 % vodný roztok K2HPO4. Pro kmeny serácií jsou toxické produkty vzniklé při společné sterilizaci glukózy a K2HPO4 při vyšším pH (reduktony).Toxicitu je částečně ruší přidání 0,1 % KJ, nebo 0,1% KCl.
Jako test citlivosti růstu byla stanovena schopnost růstu Serratia marcescens z minimálního inokula pomocí SM media v agarové formě.
Metodika byla převzata z podnikové normy pro zkoušení růstových vlastností u živného agaru č.2 Imuna.(PNY 31-102-70). Inokulum bylo ředěné 10/ – 6 až 10 /– 10, jako testovací kmen byly zvoleny různé kmeny Serratia marcescens. Srovnávací půdou byl živný agar č.2 Imuna. Obecně lze říci, že SM medium agar doahoval nižší záchyt o 30-40 % proti živnému agaru č.2. Při ředění z tekutého SM media po 40 hodinách byl zaznamenán růst i nejvyšším ředění 10-10, jak na živném agaru tak s uvedeným snížením na SM agaru. Na základě experimentálně ověřených skutečností bylo sestaveno definované médium označené pracovně jako SM:
NaCl………………… 1,4 g
KCl………………….. 1,0 g
MgSO4.7H2O………. 0,2 g
l-ornithin……………. 0,1 g
l.asparagin ………….. 1,0 g
destilovaná voda …… 1000,0 g
Jednotlivé složky postupně rozpustit zahříváním, hodnotu pH (je kolem pH 5,0) neupravujeme. Sterilizujeme 10 minut při 121 C. Po ochlazení přidáváme asepticky sterilní roztok K2HPO4 (10 %) tak aby konečná koncentrace substance činila v mediu 0,5%. Pro zvýšení aktivity nukleáz je vjdné přidat i sterilní roztok MgSO4.7H2O do konečné koncentrace 0,5 % a pro ochranu nukleáz též sterilní roztok jodidu draselného do koncentrace0,1%. Zvýšením obsahu K2HPO4 do koncentrace 1,0% se podpoří tvora pigmentu u serrátií.Lze též připravit SM medium jako agar. Navážku substancí pro jeden litr přidáme k 500 ml destilované vody a sterilizujeme popsaným způsobem.Množství agaru na na jeden litr (1-2 % podle druhu agaru) přidáme k 500 ml destilované vody, necháme nabobtnat 20 minut, rozvaříme při 100 C 40 minut a sterilizujeme autoklávováním při 121 C po dobu 20 minut, Sterilní složky ochlazené na 60 C smísíme, přidáme stejné množství roztoku K2HPO4 jako do tekutého media a vyléváme do sterilních petriho misek.
Po naočkování inkubujeme nejlépe při 20-23C, při denním osvětlení. Lze též rychleji dosáhnout růstu i při 37 C ve tmě.Další výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.
Diskuse.
Nejvyšší hodnoty extinkce bylo dosaženo v mediu obsahujícím glycerol, anorganické soli a citráty.(MM medium). Nepatrně nižšího nárustu bylo dosaženo v navrženém SM mediu. U alších použitých medií byl nárust o 20-50 %. Hodnota extinkce suspenze narostlých bakteriálních buněk v Nutrient Broth Difco byla u všech kmenů nižší než v MM mediu. V SM mediu byla hodnota extinkce u 5 z 9 kmenů vyšší než v komplexním mediu. U všech ostatních zkoušených medií byla tato hodnota vždy nižší než v Nutrient Broth Difco u všech použitých kmenů.
V rozboru složek u jednotlivých medií, lze u navrženého media poukázat na obsah dvou aminokyselin a glukosy, když je možné dosáhnout růstu i v mediu obsahujícícm jen anorganické soli a glukózu. Navržené médium má proti jmenovaným syntetickým mediím s glukózou výhodu s silnějším nárustu bakteriální hmoty a v tom, že neobsahuje žádné citráty které jsou nežádoucí při studiu a izolaci nukleáz. Totéž platí o osmotické hodnotě media a a vysokém obsahu aminokyselin u jiných medií.
Nevýhodou navrženého media je jeho vysoký obsah glukózy a tím i skutečnost, že po kultivaci značně klesne hodnota pH media. Tomu však lze při prodlužované kultivaci zabránit vyšším obsahem K2HPO4, nebo přítomností například fosfátového pufru.Skutečnost,že byly měřeny hodnoty i v oblastech. Kdy ne zcela platí přesně Lambert-Beerův zákon neznehodnocuje uvedené výsledky.
Mnohé jiné práce zabývajícíc se aplikací hodnot extikce nebo transmise na množství bakteriálních buněk v mediu tuto okolnost z praktických důvodů zcela opomíjí.
Pokračování.
Přidejte odpověď