Neurotropní agens u lovné zvěře č.4 metodika

3.4.Izolace DNA

DNA byla připravována standardně a výhradně pomocí komerčních izolačních setů firmy QIAGEN a BOEHRING MANNHEIM, souprav pro izolaci DNA z tkání QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN (katalog č.51308), a High Pure PCR Template Preparation Kit BOEHRINGER MANNHEIM (katalog 1796828), protokoly pro izolaci DNA z tkání.

Postup:

k 0,2-0,5 g tkáně bylo přidáno 180 ul lytického pufru ATL (4M urea,100mM Tris,200mM EDTA) a 20 ul roztoku s 0,8 mg Proteinázy K. Při 56 C bylo tráveno 4 hodiny, následně 18 hodin při 37 C. Poté bylo   přidáno 180 ul AL pufru (6M quanidin-HCl,10mM urea,10 mM Tris-HCl,20% Triton X-100) a pro promíchání inkubování 10 minut při 70 C. Poté bylo přidáno 210 ul 99% ethanolu, vortexováno 30 vteřin.Obsah přemístěn do izolační kolonky s adsorbční   vrstvou a inkubováno 1 minutu. Stočeno při 8000 ot/min.,dvakrát promyto 500 ul slaného alkoholu (20 mM NaCL a 2mM Tris-HCL v ethanolu) centrifugací 1 minutu při 8000 a 13000 ot/min. Absorbovaná DNA se vymyje 2 x 200 ul elučního pufru AE (10 mM Tris pH 8,5) při teplotě 70 C centrifugací po dobu 1 minuty při 8000 otáčkách. Roztok DNA je stabilní při teplotě kolem 4 C, archivovatelný po řadu let při -20 C (- 80C) bez častého rozmrazování. Je přímo použitelný pro PCR reakční směs. Výtěžek izolace je z cca 0,2 g tkáně kolem 50 ug nukleových kyselin při čistotě s indexem kolem 1.9 DNA poměru absorbance A 260/A280 nm (poměru absorbace nukleových kyselin a bílkovin ve vzorku).

 

3.5.Materiál a metoda PCR

 

3.5.1.Úvod

Polymerázová řeťezová reakce PCR (Polymerase chain reaction) jemoderní metoda velmi účinného zmnožení a detekce specifické DNA vypracovaná v roce 1983 v laboratořích Cetus Corporation v Kalifornii,prezentovaná veřejně od roku 1984 K.B.Mullisem a od téhož roku také patentovaná.(Mullis,K.B.,Faloona,E.A.1996,14) K požitelné účinné detekci hledané specifické DNA je třeba mimozákladních složek pro syntézu DNA (nukleotidy,Mg inoty,enzym polymerázu a pufrovací systém) malé množství předlohy – primeru vybrané originální sekvence specifické   pro ten který druh nositele DNA. Při použití vhodného tepelného profilu rakce mnohokrát opakované dojde k produkci tak velkého množství pomnožené části originální DNA, že je ji možné po separaci elektroforézou znázornit,   porovnáním s   velikostním markrem   a pozitivním kontrolou   identifikovat,   případně  kvantifikovat. Negativní kontroly přípravy a amplifikace složek reakce bez specifické DNA

a kontroly s nespecifickou   DNA, potvrdí věrohodnost nálezu. Případná   následná   hybridizace nebo sekvenace produktu   PCR potvrdí též náležitost amplifikátu k DNA hledaného agens.

PCR-potřeby

Příprava mixů se vzorky

 

3.5.2.Reakční směs

Pro vyšetřování byly použity komerční reakční směsi tzv.master mixy od firem QIAGEN a ROCHE. Pro PCR s horkým startem,který zabraňuje vzniku nespecifických produktů byl použit HotStarTaq Master Mix Kit QIAGEN (katalog č.203445) a pro stadardní postup PCR Master   ROCHE (katalog č.1   636 103).

Mixy ve   finální koncentraci obsahují v 100 ul: 2,5 jednotek Taq DNA polymerásy 10mM Tris-HCl,50mM KCl,1,5mM MgCl2 0,005% Brij 35 ICI,nukleotidy dATP,dCTP,dGTP,dTTP všechny v koncentraci po 0,2 mM.Hodnota pH mixu je 8,3. Master mix pro horký start firmy QIAGEN obsahuje HotStar Taq Polymerázu,která se aktivuje zahřátím na 95 C po dobu 15 minut,navíc obsahuje   (NH4)2SO4.Další podrobnosti výrobce neuvádí.

 

Předpis na 100 ul PCR mixu při použití komerčních mixů 2x koncentrovaných:

 

3.5.2.Vybrané identifikační primery

Uvedené primery pro identifikaci jednotlivých agens rutinně používá   Národní laboratoř pro   lymeskou borreliózu Státního zdravotního ústavu v Praze.

 

Přehled primerů používaných k identifikaci izolované DNA

 

zkratka: sekvence:           pro identifikaci druhu:

 

původ z genu: velikost produktu:

 

anil.teplota, koncentrace iontů Mg,koncentrace primeru,citace

—————————————————————————————————————————

 

1.*bb´

 

b 5-GAT AAA AAC GAA GAT AAT CG-3 Borr.burgdorferi (evrop.druhy)

 

b´ 5-ACT AGG ATC TGT GGA TAT TC-3           produkt: 356 bp

 

an.teplota:   37   C,   1,5   mM   MgCl2   ,   konc.   0,3   uM

 

(ROSA,P.A.,1991,15)

 

2.**cc´

 

c 5-CCA ACT TTA TCA AAT TCT GC-3 Borr.burgdorferi (všechny druhy)

 

c´5-AGG ATC TAT TCC AAA ATC-3             produkt: 123 bp

 

an.teplota:   37   C,(55*)     1,5mM   MgCl2,konc.0,3   uM

 

(ROSA,P.A.,1991,15)

 

  1. BGA 5-GGG ATG TAG CAA TAC ATC T-3     Borrelia garinii

 

BGB 5-ATA TAG TTT CCA ACA TAG T-3   16SrRNA produkt: 574 bp

 

an.teplota: 47 C, 1,5 mM MgCl2,konc. 0,5uM   (MARCONI.,1992,16)

 

  1. VSA 5-GCA TGC CAA GTC AAA CGG A-3     Borrelia afzelii

 

VSB 5-ATA TAG TTT CCA ACA TAG C-3   16SrRNA produkt: 591 bp

 

an.teplota: 47 C, 1,5 mM MgCl2,konc. 0,5uM (ROSA,P.A.,1991,17)

 

  1. ES1,2

 

P15 5-AAA GCC TGA TCC AGC TAT GCC G-3 Ehrlichia speciés

 

M7 5-CCG ACA ACG TAT TCA CCG TGG C-3 16SrRNA produkt: 979 bp

 

an.teplota:   60,5   C     2,5   mM   MgCl2,   konc.0,5uM

 

(PC/GENE ,Fidler,Z.,Hulinska D.,1976)

 

  1. OSPA-L,R5

 

L5 5-TGG ATC TGG AGT ACT TGA AGG CGT-3 Borrelia burgdorferi

 

R5 5-AGT GCC TGA ATT CCA AGC TGC AGT-3   produkt: 448 bp

 

an.teplota: 68 C, 2 mM MgCl2, konc O,5uM

 

(Manak,M.M a kol.,1997,18)

 

 

 

  1. EBV TC 67,69,BMRF1

 

TC67 5-CAG GCT TCC CTG CAA TTT TAC AAG CGG-3 Epstein-Barr virus

 

TC69 5-CCC AGA AGT ATA CGT GGT GAC GTA GA-3 BMRF1 produkt: 287 bp

 

an.teplota: 58 C, 1,5 mM MgCl2,konc.0,25uM

 

(Fiedler,Z.,Hulinska,D.,1976)

 

  1. CMV 028,029

 

028 5-AAA GAG CCC GAC GTC TAC TAC ACG T-3   Cytomegalovirus

 

029 5-CCA GGT ACA CCT TGA CGT ACT GGT C-3 pp65   produkt: 150 bp

 

an.teplota: 55 C,1,5mM MgCl2, konc.0,5uM (Yaia a kol.1990,19)

 

*)primery použité při prvním amplifikačním kroku v nested PCR

 

**)primery použité jako vnitřní v druhém ampl.kroku v nested PCR

 

(Melchers,W.,a kol.,1991,20)

 

 

 

3.5.3.Teplotní profil PCR

PCR-cykler

Termální cykler pro syntézu DNA

 

Prakticky byl používán obecně doporučovaný teplotní profil pro PCR jednoktokovou při schématu:

 

  1. předehřátí 95 C po dobu 1 minuty

 

35 krát opakovaný cyklus

 

  1. denaturace   94 C po dobu 1 minuty

 

  1. anniling 37-68 C po dobu 30 vteřin

 

  1. prodlužování 72 C po dobu 1minuty a 30 vteřin.

 

1. předehřátí 95 C 60 vteřin(15 min.) 1x
2. denaturace 94 C 60 vteřin 35x
3. anniling 37-68 C 30 vteřin 35x
4. prodlužování 72 C 90 vteřin 35x
5 závěrečné prodloužení 72 C 10 minut 1x

 

Od uvedeného obecného schématu teplotního profilu reakce se liší  profil PCR s horkým   startem (HotStar), kde je předehřátí  prodlouženo na 15 minut. Annilingová teplota rozhoduje o speificitě produktu podle dodržení vypočtené teploty. Teplota se vypočítává podle poměru obsahu párů nukleotidových basí A-C a  G-C a je určena pro ten který primer.

 

 

3.6.1.Identifikace produktu.

Produkt vzniklý v reakční směsi za přítomnosti specifických  primerů a při učeném teplotním režimu se rozdělí elektroforeticky na agarózovém gelu a po obarvení ethidiumbromidem a po porovnání s velikostním   DNA   markrem   se   odečítá   v   procházejícím ultrafialovém světle.Produkt je možné ještě verifikovat následnou hybridizací produktu, případně jej podrobit analýze restrikčními enzymy.

Koncentrace agarózového gelu se řídí podle velikosti produktu.Při produktu s velikostí 100-200 bp je koncentrace 2-3% ní, u produktů 300-500 bp je to koncentrace 1,5 % ní, při velikosti kolem 1000 bp stačí koncentrace kolem 1%. Ethidium bromid 10mg% vodný roztok se přidává přímo do rozpuštěného agarózového gelu v do finální koncentrace 0,1-0,5 ul/ml.Amplifikát se mísí v poměru 1:6 s 6x koncentrovaným vazebným roztokem, který   obsahuje bromfenolovou modř(0,25%) xylen cyanol FF(0,25%),EDTU(6mM) a Ficoll 400 polymer (15%) pH 8,0. Vazebný roztok umožní sledovat pohyb pro- duktů amplifikace (bromthymolová modř putuje v oblasti 300 bp, xylen cyanol FF v oblasti 1000 bp)EDTA zastavuje činnost zbytků polymerázy za nespecifické teploty a inhibuje produkt pro případnou kontaminaci v následných PCR stejnými primery. Ficcoll váže amplifikovanou DNA a svoji vahou ji strhává na dno jamky v gelu, výsledkem   pak je  ostřejší obrys   amplifikačního bendu   v gelu. Elekroforéza probíhá v   Tris-EDTA-kys.octová pufru (TAE 1x:Tris base 40mM,kys.octová 40mM, EDTA 1mM)při pH 7,5 působením stejnosměrného elektrického proudu 90 V,(1-10 V/cm) 120 mA po dobu 60 minut.Agaróza je rozpuštěna ve stejném pufru TAE (1x). Gel s produkty po proběhlé elektroforéze se odečítá proti velikostnímu markru v ultrafialové oblasti světla (254 nm). Dokumentuje se fotografováním před červený filtr na černobílý negativní panchromatický film 30 vteřin při cloně 5,6-8.

 

HotStarTaqMaster Mix QIAGEN (ROCHE) 50,00 ul
primer + (50pmol/1ul) 1,00 ul
primer – (50pmol/1ul) 1,00 ul
templátová DNA 20,00 ul
destilovaná sterilní voda pro PCR 28,00 ul

PCR-gel

Vzorky s pozitivní genomovou i plasmidovou DNA B.Burgdorferi

Share Button

Napište první komentář

Zanechat komentář

Your email address will not be published.


*